2017年12月
研究单位：
of Crop , of , , IL, USA
美国伊利诺伊州厄巴纳，伊利诺伊大学，作物科学系
1. 本文摘要总结（重点） 1.1 RNA-seq正在逐渐成为抗除草剂非靶位点抗性研究的重要方法
两点原因：
（1）高通量的捕获能力
（2）对无参考基因组物种具有对应的研究方法
1.2 文献调查发现抗除草剂相关的的RNA-seq成功的一些准则
（1）每个生物型应用更多的生物学重复可以显著降低假阳性，控制遗传背景，得到更小范围的候选基因
（2）混合相同材料的多个生物学重复进行测序。这样会提高假阳性，当然会有效减少实验经费开销。
（3）多数除草剂处理的研究中，采样时间和受伤的除草剂敏感材料中诱导应激反应导致结果解析困难。
（4）RNA-seq 是非靶位点基因挖掘的有效工具，但应仔细考虑：
重复数、测序深度和处理数之间考量设计相对平衡的实验方案。
2. 前言
1957年，首次有文献记载了除草剂抗性问题，这会为生产者带来越来越大的问题。理解和诊断除草剂抗性机制已成为一种除草剂管理和抗性缓解的重要组成部分。
2.1 除草剂抗除草剂主要分为两大类
（1）靶点抗性
这类除草剂作用在植物体固定的靶点底物酶，造成植物损害。
这类抗性的植物可以编码除草剂靶标酶基因发生突变，使除草剂不再与底物结合，无法发挥作用使得植物面免除损伤。
（2）非靶点抗性
与上面靶点抗性相对应，这类作用过程不涉及目标酶。可以想到这类抗性更复杂，涵盖范围更广。
其中常见的作用机制包括：
某种形式的除草剂吸收或转运减少、除草剂螯合和/或除草剂代谢增强。
靶点抗性对大多数除草剂都有很好的研究和理解，非靶点抗性的复杂性和多基因性使得揭示这类抗性机制变得困难。
目前，对基因或其他生物分子进行集体表征的实验方法（基因组学、转录组学、蛋白质组学等）正在成为发现非靶点抗性机制的关键工具。其中 RNA 测序 (RNA-seq) 已逐渐被杂草科学界采用，随着测序价格的持续大幅下降，它变得越来越普遍。
通过比较抗除草剂 (HR) 和感除草剂 (HS) 植物材料之间的转录组来揭示 NTSR 基因：
一方面可以获得基因表达差异，筛选差异基因；
另一方面可以获得差异材料间核苷酸序列变化，寻找可能的突变。
通常，经过比较获得转录本可能数目很大，得到的候选基因集存在大量的假阳性结果。
2.2 本综述的目的
（1）检查和总结目前围绕基于 RNA-seq 的 NTSR 基因发现方法的文献； (2) 使用本摘要为未来的 RNA-seq 实验提供指导和最佳实践。介绍五个部分的注意事项，总结前人工作的主要经验。
3. 文献中总结的经验（） 3.1 生物学重复越多越好（目前广泛的都是3个生物学重复）
材料的遗传背景复杂度（草类遗传背景复杂）和基因表达的稳定性（不同重复之间基因表达差异）这两个因素值得考量，更多的生物学重复有助于获得更少、更准确的差异基因集。
一方面加速实验进程，另一方面激发研究生等科研人的热情，毕竟长时间的积累工作可能对于短时间毕业的研究生来说没有希望。当然实验设计（实验重复等）需要和课题目标、课题投入进行权衡，设计个性化的实验方案。
3.2 混合生物学重复样本测序（RNA-seq）会增加假阳性
如果考虑多个因素（群体大小，生物学重复，不同处理和多个时间点设计等信息），会显著增加实验成本。
解决这个问题，可以考虑将相同材料的不同生物学重复混合在一起，然后进行RNA-seq测序，随后分析不同RNA混合样本之间的基因表达差异。
这样做有一定的道理，理论上可以将生物学背景的差异或者噪音平均，得到不同生物学处理的差异表达基因。
这样做也面临一些分析风险：
（1）确保池中每个样本的平等代表性对于正确解释结果至关重要。如果在文库制备之前样本混合不均匀，结果可能具有高变异性，因此准确性低。
（2）混合样本的个体数目，通常在10到20的数目之间是更划算和具有统计效果，可以检测75%的差异基因。
合并样本会造成假阳性，特别是对于整体表达量不高的基因，其本身表达变异大，容易被鉴定为差异基因。
（3）基于作者未发表数据的模拟分析显示，多样本混合效果低于少量的单个测序；相同样本的单独测序优于相同数目样本的混合结果。
基于已经发表数据，并未有足够的证据证明，不能确切的推导出这个结论。包含足够个体的生物学重复测序是最佳方案，混合样本结果可能还是得到大量的候选基因。
3.3 材料的遗传背景差异
遗传背景差异一直是RNA-seq项目的重要问题，因为不同地理区域和不相关的两个群体，可能会存在差异表达基因，这些基因是由于遗传漂变和区域适应性造成的，并非是研究关注的除草剂相关基因。
目前控制遗传背景的方法可以通过单个群体的轮回选择；也可以选择F2分离群体进行研究，以此降低材料间遗传背景差异对结果的影响。
举例而言，相比较雨水充足的地区，干旱地区的材料抗旱基因的表达量会积累，因此这种情况下，两个背景差别大的群体材料，在除草剂处理时，抗旱基因也会被检测出来作为除草剂的候选基因，增加了结果的假阳性。
3.4 除草剂处理材料的解析（组成型基因差异和取样时间）
在除草剂RNA-seq研究中发现，得到的差异基因列表中包括组成型差异表达基因。优势除草剂会诱导组成型基因高表达，有时材料在未受到除草剂处理时，抗性和感性材料中仍然能够检测到差异表达的组成型基因。有两个对立的解释，一方面可能非靶点抗性相关基因在组成型基因中起作用；另一方面也可能这类基因会造成结果的假阳性，这类基因的作用并不大。
非靶点抗性研究中，一个困难是抗性和感性材料均会上调，可能二者的差别是反应时间点不同，抗性材料反应更快。
因此另一个重要的问题是取样的时间点非常重要，同时，多个时间点的取样材料虽然增加试验成功的可能性，但是，大幅度提高了科研预算。
对于抗性和感性材料，二者对除草剂的响应不同，通常感性材料对除草剂的反应更大，会诱导植物应激反应，死亡和损伤调控途径的变化，这部分基因由于表达差异变化大，很容易被鉴定为除草剂相关基因，从而影响结果的准确性。
尽管如此，还是有成功的研究例子，可以鉴定到除草剂相关响应基因。
3.5 RNA-seq结果的验证
RNA-seq 是评估生物型之间转录差异的有效方法，但本质上仅限于检测植物生命周期中单个时间点的转录水平变化。
许多情况下，在转录水平上观察到的差异在蛋白质水平上没有观察到，说明了转录后和翻译后修饰对最终蛋白质表达的影响。出于这个原因，需要进行后续实验来确认蛋白质表达和代谢物产生的差异。
通常有qPCR实验以及其他分子转化实验验证。
参考：
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