本发明涉及生物，具体涉及一种水稻抗草铵膦除草剂基因及其应用。
背景技术：
1、水稻是重要的粮食作物之一，全球一半以上的人口以水稻为主食。在我国，其总面积、总产量和单位面积产量均居各类粮食作物的首位。在水稻的生产过程中，田间的杂草危害严重影响水稻的产量，防除稻田杂草形势严峻。随着直播稻栽培技术的推广，控制杂草的问题更加突出。直播稻田的杂草危害比移栽稻田重，而且防除更加困难。
2、草铵膦属于膦酸类除草剂，能够抑制植物氮代谢途径中的谷氨酰胺合成酶，从而干扰植物的代谢，使植物死亡。草铵膦具有杀草谱广、低毒、活性高和环境相容性好等特点，应用前景广阔。但是普通水稻不具有抗草铵膦除草剂的抗性，导致草铵膦不能应用于水稻田的杂草防治中。
3、为了减少水稻田中杂草，并且保证水稻的生长和产量，获得能够抗草铵膦除草剂抗性的水稻具有重要意义。获得抗草铵膦除草剂的基因对快速培育抗草铵膦除草剂水稻新品种具有十分重要的作用。
4、公开号为的中国专利公开一种草铵膦耐受性稻，在稻基因组特定位点存在启动子控制下的bar基因。但基于转基因品种商业化复杂的申报程序以及人们对转基因稻米安全性的担忧，现阶段很难在生产上得到推广应用，而且抗草铵膦除草剂转基因水稻品种在我国推广应用还受到国外专利的限制。因此，该专利还有待进一步完善。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于如何解决现有技术中的草铵膦抗性基因的应用依赖转基因技术，提供一种非转基因抗草铵膦突变基因glr6，通过利用glr6基因的定点改造，可培育抗草铵膦除草剂水稻新品种。
2、本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
3、一种抗草铵膦除草剂水稻突变体glr6的突变位点，所述突变位点为一个单碱基替换和一个单碱基缺失，突变位点位于基因上。
4、基因为抗草铵膦除草剂基因glr6。
5、一种抗草铵膦除草剂水稻突变体glr6的控制基因glr6，所述基因glr6的核苷酸序列，(1)如.1或.2所示；或(2)添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列；(3)或与.2所示核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制水稻抗草铵膦除草剂的核苷酸序列。
6、所述严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交(0.25mol/l磷酸钠缓冲液，ph7.2，7％sds)中，65℃预杂交30分钟；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/l磷酸钠缓冲液，ph7.2，7％sds，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交16小时；弃杂交液，加入洗膜液ⅰ(/l磷酸钠缓冲液，ph7.2，0.1％sds)，65℃洗膜2次，每次10-15分钟；加入洗膜液ⅱ(/l磷酸钠缓冲液，ph7.2，0.1％sds)，65℃洗膜10-15分钟。
7、所述.1核苷酸序列涉及基因glr6的启动子、编码区和调控区。
8、本发明利用重离子辐照中国粳稻品种金粳818获得一个不影响产量相关的农艺性状，如株高、分蘖数、穗粒数、千粒重等，具有草铵膦除草剂抗性的水稻突变体glr6。
9、本发明通过对glr6突变体进行遗传分析群体构建，对其进行遗传行为分析，发现glr6突变体的抗草铵膦除草剂抗性是有突变后的glr6单基因隐性控制。
10、有益效果：本发明通过图位克隆的方法分离鉴定出一个抗草铵膦除草剂基因glr6，通过对材料的表型分析及遗传互补实验，证实了glr6基因在调控水稻草铵膦除草剂抗性上具有一定的功能。
11、基因glr6为今后从分子水平阐明水稻对草铵膦除草剂抗性的调控遗传基础，以及水稻基于分子设计的环境友好型新品种育种提供理论依据及材料和基因支持。
12、一种水稻草铵膦除草剂抗性的控制基因glr6编码蛋白，所述基因glr6编码蛋白的氨基酸序列，(1)如.3所示；或(2)由一个或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与.3所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列；或(3)与.3所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的氨基酸序列；或(1)、(2)、(3)所述氨基酸序列的活性片段。
13、一种重组构建体，所述重组构建体含有水稻草铵膦除草剂抗性的控制基因glr6的核苷酸序列，所述重组构建体所用的载体为克隆载体或用于表达所述核苷酸的表达载体。
14、一种重组宿主细胞，包括上述重组构建体的宿主细胞，或在其基因组中整合有本发明所述的控制水稻草铵膦除草剂抗性基因glr6的多核苷酸序列。所述宿主细胞可以选自植物细胞或者微生物细胞，例如大肠杆菌细胞或农杆菌细胞，优选植物细胞，最优选水稻细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的或者是植物的一部分。
15、本发明公开了利用glr6突变体和通过glr6突变位点获得抗草铵膦除草剂的水稻品种，以及利用各种手段，包括上述的物理诱变、化学诱变和生物诱变以及基因编辑技术，使得glr6基因功能缺失突变而获得的抗草铵膦除草剂水稻品种。
16、优选地，所述宿主细胞为植物细胞或微生物细胞。
17、优选地，所述植物细胞为水稻细胞；所述微生物细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。
18、一种培育抗草铵膦除草剂水稻的方法，包括以下步骤：利用诱变的手段，所述的诱变手段包括物理诱变，化学诱变和生物诱变，或经基因编辑技术使得上述水稻抗草铵膦除草剂突变体glr6的控制基因glr6功能缺失的水稻植株，其中所获得的水稻植株表现出抗草铵膦除草剂表型。
19、一种培育抗草铵膦除草剂水稻的方法，包括以下步骤：将带有上述突变位点的水稻抗草铵膦除草剂突变体glr6与其他水稻品种杂交，通过后代分离获得草铵膦除草剂抗性的水稻植株。
20、采用上述方法获得的水稻植株或品种在抗草铵膦除草剂上的应用。
21、本发明的优点在于：
22、本发明的glr6的等位变异以及基因编辑的功能缺失突变体中，苗期具有草铵膦除草剂抗性，利用该突变体水稻在直播种植中，可以使用草铵膦除草剂进行田间杂草处理，从而快速达到田间杂草的清除。
技术特征：
1.一种水稻抗草铵膦除草剂突变体glr6的突变位点，其特征在于，所述突变位点为一个单碱基替换和一个单碱基缺失，所述突变位点位于基因上。
2.一种水稻抗草铵膦除草剂突变体glr6的控制基因glr6，其特征在于，所述基因glr6的核苷酸序列，(1)如.1或.2所示；或(2)添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列；或(3)与.2所示核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制水稻抗草铵膦除草剂的核苷酸序列。
3.一种水稻抗草铵膦除草剂突变体glr6的控制基因glr6编码蛋白，其特征在于，所述基因glr6编码蛋白的氨基酸序列，(1)如.3所示；或(2)由一个或多个氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与.3所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列；或(3)与.3所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列；或上述(1)、(2)、(3)所述氨基酸序列的活性片段。
4.一种重组构建体，其特征在于，所述重组构建体含有权利要求2所述水稻抗草铵膦除草剂突变体glr6的控制基因glr6的核苷酸序列，所述重组构建体所用的载体为克隆载体或用于表达所述核苷酸的表达载体。
5.一种重组宿主细胞，其特征在于，包括权利要求4中重组构建体的宿主细胞，或在包含权利要求1所述的水稻抗草铵膦除草剂基因glr6的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为植物细胞或微生物细胞。
7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述植物细胞为水稻细胞；所述微生物细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。
8.一种培育抗草铵膦除草剂水稻的方法，其特征在于，所述方法包括：利用诱变的手段，所述的诱变手段包括物理诱变，化学诱变和生物诱变，或经基因编辑技术使得如权利要求2所述的水稻抗草铵膦除草剂突变体glr6的控制基因glr6功能缺失的水稻植株，其中所获得的水稻植株表现出草铵膦除草剂抗性的表型。
9.一种培育抗草铵膦除草剂水稻的方法，其特征在于，将带有权利要求1所述的突变位点的水稻抗草铵膦除草剂突变体glr6与其他水稻品种杂交，通过后代分离获得草铵膦除草剂抗性表型的水稻植株。
10.一种权利要求8或9所述方法获得的水稻植株或品种在抗草铵膦除草剂上的应用。
技术总结
本发明公开一种水稻抗草铵膦除草剂基因GLR6及其应用，涉及生物技术领域，所述基因GLR6的核苷酸序列，(1)如.1或.2所示；或(2)添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列。本发明还提供基因GLR6的编码蛋白、重组构建体、重组宿主细胞以及利用基因GLR6使水稻具有草铵膦除草剂抗性的方法及应用。本发明的有益效果在于：GLR6的等位变异以及基因编辑的功能缺失突变体中，苗期具有草铵膦除草剂抗性，利用该突变体水稻在直播种植中，可以使用草铵膦除草剂进行田间杂草处理，从而快速达到田间杂草的清除。
技术研发人员：叶亚峰,刘斌美,吴跃进,张从合,方玉,陶亮之,任艳,詹玥
受保护的技术使用者：中国科学院合肥物质科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12